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Dans le domaine de la santé, le diagnostic constitue l’une des pierres angulaires des décisions médicales, des politiques de santé publique et de la prévention des épidémies. Comme 70% des prises de décision médicale reposent sur le résultats d’un test de diagnostic in vitro, la fiabilité des examens de biologie médicales représente un enjeu majeur de santé publique.

Un moyen privilégié pour répondre à ce besoin de fiabilité est d’établir la traçabilité métrologique des résultats de mesure aux unités du système international (SI), notamment par le biais de méthodes de référence et de matériaux de référence. Actuellement, force est hélas de constater que, contrairement aux autres domaines de la mesure, les résultats des examens de biologie médicale basés sur un test de diagnostic in vitro ne sont pas toujours traçables à des références reconnues internationalement. Or, le règlement 2017/746 de l’UE relatif aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro exige que la traçabilité des valeurs associées aux matériaux d’étalonnage et de contrôle de la qualité aux méthodes de référence et aux matériaux de référence certifiés disponibles.

Depuis plus de 15 ans, le département « Bioanalyses » développe des méthodes de référence par spectrométrie de masse et des matériaux de référence certifiés pour des biomarqueurs de pathologie très variées avec l’objectif:

  1. d’assurer la traçabilité métrologique des résultats aux unités SI et améliorer la comparabilité des résultats fournis par les différentes méthodes de mesure utilisées en routine dans les laboratoires de biologie médicale;
  2. d’évaluer la justesse et la comparabilité des résultats fournis par les méthodes utilisées en routine dans les laboratoires de biologie médicale

Le LNE, acteur fondamental dans la fiabilité du diagnostic de pathologies

Le LNE répond au besoin de différents acteurs impliqués dans la santé du citoyen : les patients, les médecins et cliniciens, les biologistes, les fabricants de diagnostic in vitro, les pouvoirs publics.

Maladies cardiovasculaires : une nécessité de disposer de biomarqueurs plus fiables

Depuis 2011 le LNE a développé des compétences dans les mesures de biomarqueurs liées au maladies cardiovasculaire. Ainsi le laboratoire est aujourd’hui reconnu laboratoire de référence pour le dosage du cholestérol total, du cholestérol-LDL et du cholestérol-LDL par spectrométrie de masse. Par ailleurs le laboratoire est accrédité par le COFRAC selon les référentiels ISO 15195 et ISO 17025 pour ces biomarqueurs ainsi que pour les triglycérides. Ces méthodes sont utilisées pour assigner des valeurs cibles à des Matériaux de Référence Certifiés, à des étalons industriels et à des échantillons de contrôle de qualité. Le laboratoire est membre du CRMLN (Cholesterol Reference Method Laboratory Network).

Par la suite, le laboratoire a complété son expertise en développant des activités relatives à l’analyse avancée de lipoprotéines dans le cadre du projet Européen BioSITrace. Ces travaux se sont poursuivis avec l’implication du département Bioanalyses dans le groupe de travail IFCC sur la standardisation des apolipoprotéines et le projet Européen CardioMet. Dans le cadre de ces projets le laboratoire contribue au développement d’une nouvelle chaine de traçabilité pour le dosage simultané d’un panel de 7 apolipoprotéines (apoA-I, B, C-I, C-II , C-III, E et apo (a)).

Enfin, le laboratoire travaille activement sur l’estimation du risque résiduel non diagnostiqué par les outils conventionnels. Ces travaux ont fait l’objet d’un article publié dans The Lancet, une des plus prestigieuses revues médicales au monde. Cette étude, menée aux côtés de chercheurs australiens et suédois, a démontré qu’environ 15 % des patients victimes d’un infarctus aigu du myocarde ne présentaient aucun facteur de risque. Ces résultats soulignent le besoin de disposer de biomarqueurs permettant d’identifier de manière plus fiable les patients présentant le risque le plus élevé de développer des maladies cardio-vasculaires avant la survenue de celles-ci.

LNE, centre nerveux de la prévention des maladies neurodégénératives

Illustration-JRP-Neurobiostand
Le projet Européen NEuroBioStand a pour ambition de développer des méthodes de référence pour le dosage de pTau, NfL et GFAP dans le sang

Depuis plus de 10 ans, le laboratoire travaille sur le développement de méthodes de référence pour le   dosage de biomarqueurs de maladies neuro-dégénératives et en particulier la maladie d'Alzheimer. A travers les projets Européens NeuroMet et NeuroMet 2, le laboratoire a développé une expertise reconnue sur l’analyse de la protéine Tau par spectrométrie de masse. La protéine tau totale (T-tau) est couramment mesurée dans le liquide céphalorachidien (LCR) comme biomarqueur diagnostique de l’Alzheimer et est utilisée pour la stratification des patients. Sa concentration est corrélée à la progression de la maladie, bien qu'elle soit désormais considérée comme un biomarqueur moins spécifique que la protéine tau phosphorylée (P-tau), permettant de mieux définir le degré de la neurodégénérescence et du déclin cognitif. Une méthode de référence candidate ciblant T-tau dans le LCR a été récemment validée par le LNE en exploitant le potentiel de la dilution isotopique couplée à la spectrométrie de masse (ID LC-MS/MS) et l'utilisation d'un étalon primaire protéique traçable au Système International (SI). Une étude a été menée pour évaluer la faisabilité du développement d'une quantification traçable au SI de la protéoforme particulière de tau portant une phosphorylation sur la thréonine 181 (P-tau181). Dans le cadre d’un projet financé par l’association « France Alzheimer et maladies apparentés », le LNE et le CHU de Montpellier (Prof Hirtz et Prof Lehmann) ont développé des méthodes d’analyse permettant le profilage d’un panel de formes phosphorylées.

Ces différents travaux ont mené le LNE a coordonner le projet Européen NEuroBioStand, qui a pour ambition de développer des méthodes de référence pour le dosage de pTau, NfL et GFAP dans le sang ainsi que des approches pour la caractérisation structurale de Tau. Le travail du LNE se concentre sur P-tau, qui est désormais considéré un biomarqueur clé pour établir un diagnostic précoce de la maladie d’Alzheimer plusieurs années avant que les premiers symptômes de la maladie n’apparaissent. L'utilisation de tests sanguins non invasifs réduira le recours à l'imagerie pour les dépistages à grande échelle, limitant ainsi les coûts pour le système de santé.

Hormones stéroïdiennes et métrologie : pour une mesure fiable à très faible concentration dans des matrices biologiques

Les hormones stéroïdiennes sont des biomarqueurs sanguins utilisés pour le diagnostic et le suivi thérapeutique de patients. Une légère variation de la concentration sanguine de ces hormones, de l’ordre du ng/mL voire du pg/mL, peut dans certains cas révéler le développement de certaines maladies (par exemple des tumeurs, des troubles de la reproduction, la trisomie 21 pendant la grossesse), une exposition à des perturbateurs endocriniens, ou peut entraîner des problèmes de santé majeurs. Il est donc crucial de disposer de méthodes robustes, spécifiques et exactes capable de les quantifier à ces niveaux de concentration.

Dans le cadre d’une approche ONE-HEALTH, le LNE a initié en 2018 le développement d’une méthode de quantification par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse de 23 hormones stéroïdiennes d’intérêt majeurs en santé humaine et en environnement. Un défi analytique a dû être relevé afin de quantifier l’ensemble de ces molécules dans diverses matrices complexes que sont le sérum humain ou les eaux environnementales. Les performances de la méthode développée sur les matrices biologiques n’étant pas encore au niveau d’une méthode de référence, des développements sur la préparation d’échantillon et la séparation chromatographique se sont poursuivis afin d’améliorer les limites de quantification et les incertitudes de mesures pour la quantification de la testostérone, du 17β-estradiol et de l’aldostérone dans le sérum humain.

Sepsis : des armes affûtées pour un diagnostic rapide

Priorité de l’OMS, le sepsis – réponse inflammatoire consécutive à une infection – cause chaque année près de 11 millions de décès dans le monde. Son diagnostic précoce, reposant sur une approche combinant évaluation des signes cliniques, tests bactériologiques et dosage de biomarqueurs sanguins, est essentiel à la survie des patients, mais représente toujours un défi pour les cliniciens. En 2016, le laboratoire a initié des travaux de recherche visant l’amélioration de ce diagnostic, notamment en s’intéressant au développement d’un système de référence pour la mesure de la protéine procalcitonine, l’un des biomarqueurs couramment utilisés en clinique pour le diagnostic du sepsis et la gestion du traitement antibiotique en cas d’inflammation bactérienne. Le LNE a œuvré afin de combler les besoins liés au dosage de la procalcitonin, dont les résultats de mesure n’étaient pas traçables au système international d’unités (SI) et dont la comparabilité de ces résultats pose question. Ainsi, le développement de la première méthode de référence primaire candidate pour le dosage de la procalcitonine par spectrométrie de masse dans le cadre des projets européens AntiMicroResist et SEPTIMET, a permis de proposer un cadre métrologique. Grâce à cela, des valeurs de référence pourront être assignées à des matériaux de référence certifiés, qui permettront d’évaluer à la fois la fiabilité et la comparabilité des résultats fournis par les différentes méthodes de dosage utilisé dans les laboratoires de biologie médicale. Recourir à un seul biomarqueur semble insuffisant face à l’urgence de la prise de décision des cliniciens. Face à ces enjeux, le projet européen SEPTIMET a permis de développer une méthode de dosage d’un panel de biomarqueurs du sepsis.

Le LNE a également proposé la création d’un groupe de travail IFCC (Fédération internationale de chimie clinique et de médecine de laboratoire) sur la standardisation de la procalcitonine (IFCC WG-PCT) et coordonne les différentes activités de ce groupe depuis sa création en 2018.

Diabète

Le laboratoire a développé une méthode de référence pour le dosage du glucose, qui a été utilisée pour assigner des valeurs cibles à des Matériaux de Référence Certifiés.

Le laboratoire est également un laboratoire de référence pour le dosage de l’hémoglobine glyquée HbA1c.

A travers le projet Européen COMET, il est prévu d’évaluer la commutabilité de matériaux de contrôle de qualité afin de vérifier la fiabilité des lecteurs de glycémie et des dosages conventionnels de glucose dans le sang.

Insuffisance rénale

Le laboratoire dispose d’une méthode de référence pour le dosage de la créatinine sérique, qui a été utilisée pour assigner des valeurs cibles à des Matériaux de Référence Certifiés. Le laboratoire est également impliqué dans des travaux sur la standardisation des dosages de Cystatine C et d’albumine urinaire.

Protéines : que mesurons nous exactement ?

Illustration-JRP-promet
Le LNE coordonne le projet européen PROMET qui vise à mieux caractériser la structure des protéines

Les protéines sont des macromolécules complexes, dynamiques et hétérogènes qui remplissent des fonctions biologiques vitales dans tous les processus des cellules vivantes et sont constituées d'une séquence de plus petites molécules appelées acides aminés. En métrologie, de nombreux travaux se sont basés sur cette séquence d’acides aminés. Ainsi, le LNE a développé ses capacités à quantifier les protéines par analyses des acides aminés, c’est-à-dire en découpant la protéine pour obtenir un mélange d’acides aminés libres. Il est accrédité par le COFRAC selon les référentiels ISO 15195 et ISO 17025 pour le dosage d’acides aminés en solution ainsi que le dosage de peptides et protéines après hydrolyse en acides aminés, tout cela en mettant en œuvre la dilution isotopique et la spectrométrie de masse. Ces analyses ne permettant pas d’analyser une protéine donnée dans un mélange complexe lui-même constitué de nombreuses protéines, elles sont utilisées pour quantifier des protéines pures en vue de leur certification en tant que matériaux de référence primaire. Pour ces matériaux, il a été nécessaire que le laboratoire développe des méthodes permettant d’établir leur pureté. Ainsi, le laboratoire utilise la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS) afin d’identifier si d’autres protéines (impuretés) sont présentes dans l’échantillon.

Cependant, les protéines ne sont pas uniquement caractérisées par leur séquence d’acides aminés (structure primaire), mais par leur structure globale avec également le repliement dans l'espace de cette séquence (structure secondaire et tertiaire) et l'agrégation de plusieurs séquences (structure quaternaire). Ainsi il est nécessaire de pouvoir différencier les protéines au niveau de leur structure tridimensionnelle pour améliorer la mesure de la pureté des matériaux de référence primaire. De plus, la fonction biologique d’une protéine est fortement associée à sa structure et peut être affectée par des changements structurels. Ainsi, une même protéine peut donner lieu à un mélange complexe de différentes versions de la protéine, appelées protéoformes, présentant différentes fonctions biologiques. La caractérisation structurale et l’identification de la cible à mesurer, à savoir le mesurande, est donc crucial et représentent l'un des principaux défis pour ces molécules hétérogènes et dynamiques.

En métrologie, la caractérisation de la structure globale en est encore à ses débuts. Au travers du projet européen ProMET coordonné par le LNE, la communauté métrologique s’associe aux instituts de recherches académiques fortement impliqué dans la caractérisation structurale de protéine afin de

  • développer des méthodes exactes pour la caractérisation de l'ensemble de la structure (primaire à quaternaire),
  • étendre les développements métrologiques, actuellement axés sur l'analyse de la structure primaire, à la structure d'ordre supérieur,
  • évaluer l'impact de la structure sur les résultats des mesures effectuées en routine
  • fournir des outils permettant de mieux définir le(s) mesurande(s) associé(s) à une (des) protéoforme(s) spécifique(s).

Le LNE au service du développement de matériaux de références

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Grâce à ses activités de recherche, le LNE a développé des Matériaux de Référence Certifiés pour certifier la concentration de différents biomarqueurs

Le LNE dispose des moyens et des compétences pour la certification de la concentration de différents biomarqueurs dans des solution étalon et/ou des échantillons biologiques : glucose, HbA1c, créatinine, cholestérol total, triglycérides, cholestérol-HDL, cholestérol LDL, acides aminés (Alanine, Leucine, Isoleucine, Phénylalanine, Valine, Proline), peptides et protéines. Ces activités sont accréditées par le COFRAC selon les référentiels ISO 15195 et ISO 17025. Le laboratoire est également reconnu par le JCTLM (Comité mixte pour la traçabilité en médecine de laboratoire) comme laboratoire de référence.

Le laboratoire a développé des Matériaux de Référence Certifiés pour le glucose, l’HbA1c, la créatinine, le cholestérol total, les triglycérides, le cholestérol-HDL, le cholestérol LDL, l’urée et l’acide urique.

La commutabilité (capacité à mimer le comportement d'échantillons de patient) étant une propriété d'un matériau de Référence Certifié, le laboratoire a développé des compétences reconnues internationalement et offre la possibilité d'évaluer la commutabilité de matériaux d'étalonnage et de contrôle de qualité pour différents biomarqueurs, différentes matrices et différentes méthodes de dosage. Cette expertise s’appuie entre autres sur les activités réalisées dans le cadre du projet Européen COMET, qui est coordonné par le LNE.

Thèses co-encadrées

2006-2009 : thèse de Karène Saint-Albin  « Fiabilité des analyses médicales : démonstration et application au dosage du glucose » réalisée sous la direction de Philippe Gillery (CHU de Reims)

2011-2013 : thèse de Maud Heuillet « Développement de méthodes de référence pour les biomarqueurs du bilan lipidique : application au contrôle qualité en biologie clinique » réalisée sous la direction de Laurence Duvillard (CHU Dijon).

2013-2016 : thèse de Pauline Bros « Développement de méthodes de référence pour spectrométrie de masse pour le dosage de biomarqueurs de la maladie d'Alzheimer » réalisée sous la direction de Christophe Hirtz (CHU Montpellier).

2015-2017 : thèse de Noémie Clouet-Foraison « Caractérisation métrologique de méthodes de références primaires candidates pour l’énumération des lipoprotéines et le dosage de l’hémoglobine glyquée HbA1c » réalisée  sous la direction de Philippe Gillery (CHU de Reims).

2018-2020 : thèse de Huu Hien Huynh « Développement d’une méthode de référence candidate pour la quantification de la procalcitonine dans le sérum humain », réalisée sous la Direction de Joëlle Vinh (ESPCI).

2020-2023 :  thèse de Maxence Derbez-Morin « Développement de méthodes de quantification de biomarqueurs de diagnostic du sepsis par spectrométrie de masse » réalisée sous la Direction de François Becher (CEA).

2019-2021 : thèse d’Elodie Mirmont « Développements de méthodes de quantification par spectrométrie de masse d'hormones stéroïdiennes et de composés apparentés dans des matrices environnementales et biologiques », réalisée sous la direction du Pr. Olivier Laprevote (UMR8038, Université Paris Cité)

2023-2025 : thèse de Chloé Duret « Développement de méthodes de quantification par spectrométrie de masse pour les hormones stéroïdiennes dans des matrices biologiques et environnementales » sous la direction de Valérie Pichon (ESPCI)

2024-2026 : thèse de Samy Messaoudi « Développement de méthodes de quantification par spectrométrie de masse de biomarqueurs impliqués dans les maladies neurodégénératives » réalisée sous la Direction de Joëlle Vinh (ESPCI).

Participation à des comités et groupes de travail

  • Coordination du réseau Européen de métrologie TraceLabMed (EMN-TLM)
  • Participation au Groupe de travail CCQM sur la chimie organique (CCQM-OAWG)
  • Participation au Groupe de travail CCQM sur l’analyse de protéines (CCQM-PAWG)
  • Participation au Groupe de travail JCTLM sur la promotion de la traçabilité (JCTLM WG-TEP)
  • Participation au Groupe de travail JCTLM sur l’implémentation de systèmes de référence (JCTLM TF-RMSI)
  • Participation au comité exécutif de la division scientifique de l’IFCC (IFCC SD-EC)
  • Participation au Groupe de travail IFCC sur la commutabilité (IFCC WG-CMT)
  • Participation au Groupe de travail IFCC sur la standardisation des apolipoproteines (IFCC WG-ApoMS)
  • Participation au Groupe de travail IFCC sur les biomarqueurs des maladies neurodégénératives (IFCC WG-BND)
  • Participation au Groupe de travail IFCC sur les biomarqueurs du métabolisme osseux (IFCC C-BM)
  • Coordination du Groupe de travail IFCC sur la standardisation des dosages de procalcitonine (IFCC WG-PCT)
  • Participation au Groupe de travail IFCC sur la bilirubine néonatale (IFCC WG-NB)
  • Participation au Comité de Section Santé Humaine du COFRAC
  • Participation au comité de normalisation ISO TC 212
  • Participation au comité de normalisation AFNOR S94C

Publications

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